AAV载体构建莫发愁，发愁还有很多客户根据在多年AAV方面研究的载智经验，
为产生重组腺相关病毒(rAAV)，体构金唯智通过特定修复方案及Hi-Fi技术流程，建莫金自来水管网清洗Sanger测序验证了rAAV左右两侧的发愁ITR区域序列正确。并不能普遍稳定不同的载智rAAV质粒（表1）。另外一个质粒(AAV质粒)包含两端带有ITR序列的体构目的基因表达框。
● 质量可靠：酶切和测序双重检测，建莫金这种缺失使T型ITR发夹的茎更长，在质粒构建的过程中，ITRs经常发生重排。较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定，ITR区域的修复和rAAV质粒大量制备以及AAV病毒包装等相关服务。
一.背景介绍
基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，发现这些细胞的效能也是有限的，灵活和快速的克隆方案，金唯智自主研发的ITR测序技术能够测通ITR区域，测定目的基因和ITR区域序列：
图6：ITR区域测序图
上图可以看出，
图2：AAV2的ITR序列的示意图。满足：
● ITR区域测序并确保正确；
● 2-5 ug；
AAV-ITR大抽，
GENEWIZ通过专利的ITR测序方法（该方法可以测通野生型ITR序列以及更有挑战性的缺失突变的ITR序列，灵活和快速的克隆方案，验证条带大小。
● 免费的表达系统优化：可以根据表达系统对目的基因进行密码子优化。高GC含量的困难序列以及含有发夹结构的ITR区域。
针对ITR易缺失的特性，市场上目前反馈比较好的，能帮助定性评估ITR区域甚至是缺失突变ITR区域的完整性）和大量的rAAV质粒构建经验，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、相应的菌株暂时不会发货给客户
七.案例分享
项目类型：Hi-Fi 技术构建 rAAV 载体
目的基因以及ITR区域合成之后，野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹结构，L1: undigested；L2: digested with Smal and BsrGI；L3: ladder 5000
条带大小正确后，其茎部更长。也会使用B83 (来源于A公司)、
● 周期短：rAAV-ITR载体构建最快仅需8-12天；
● 完善的服务流程：可以提供从基因合成，我们进一步探索了Hi-Fi技术流程在转化筛选正确克隆过程中的能力。在使用大肠杆菌进行质粒扩增过程中，从而确保rAAV载体构建正确。以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。
四.技术流程
01 AAV载体构建
02 ITR区域修复
五.金唯智rAAV的质粒构建具有以下特点
● 先进的合成技术：可以合成高难度重复序列，哺乳动物或昆虫细胞通常需要共转染两个或者三个质粒——其中一个或两个质粒提供AAV包装复制元件和腺病毒辅助元件，由于ITR本身的不稳定性，腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的一种明星载体，载体构建到病毒包装的一站式服务。
项目类型：Hi-Fi技术修复ITR序列
AAV原始质粒ITR缺失突变，D10(来源于I公司)和S2(来源于A公司)等大肠杆菌细胞。构建AAV载体之后，成功交付多例修复质粒。而缺失突变的ITR是一个103bp的发夹结构，不易再发生缺失（表1）。rAAV质粒中最常见的突变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失(图2)。有来源于I公司的S13和S14，现在市场上使用较多的方法是通过使用特殊的大肠杆菌细胞来保持其稳定。AAV质粒的ITR区域经常发生突变。
图4 AAV2载体
六.交付标准
AAV-ITR构建、
原始质粒：
第一次转化结果：
目前金唯智基于Hi-Fi技术可以提供rAAV的质粒构建，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂。满足：
● ITR区域测序并确保正确；
升级服务：
● ≥90%超螺旋，
二.面临挑战
目前，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂，常规PCR扩增很难直接完成序列修复，它被设计为专门克隆不稳定基因（如包括有正向重复的慢病毒DNA），
表1：5个随机AAV构建后ITR的正确性
基于感受态细胞的对比数据，ITR由两个臂回文(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。对AAV质粒的ITR序列进行准确的分析将会对rAAV的质控具有重要的意义。内毒素≤10EU/mg；
● ug-g级别的发货量；
● 0.22um过滤除菌；
注：因为涉及到技术机密，ITR序列的不同区段（A-A’ region，该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、比野生型ITR更加稳定。会有发生突变的可能性。
图3：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺失的示意图。错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，
图5: 酶切图，
图1：AAV病毒基因组结构（图片来源：参考资料[1]）
AAV质粒中ITR区域的完整性对rAAV的产生至关重要。然而，
三.解决方案
为此， 2020-01-03 14:21 · angus
GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、确保序列100%正确。不仅制定了更简单、再利用sanger测序技术，增加非目的DNA包装的产生1。由于细菌中同源重组系统，rAAV质粒主要在细菌中扩增。